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免疫荧光技术的操作方法流程
发布时间:2013-08-14   点击次数:1475次

 根据实验室技术案例,以下为大家分享免疫荧光技术的操作方法流程。

免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)是根据抗原-抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原物质或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。

免疫荧光技术的操作流程:

(1)选取一抗时要来源于两种不同的新葡萄京娱乐场,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

(2)我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗4度孵育过夜比较好,背景比较清晰。

(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和新葡萄京娱乐场-新葡萄京娱乐场的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

(4)封闭血清与二抗来源新葡萄京娱乐场一致,我用的是10%的正常donkey血清。

(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

免疫荧光技术的使用方法:

(1)直接荧光法 将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少;缺点是敏感性偏低,而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等病原微生物的快速鉴定。

(2)间接荧光法 用一抗与标本中抗原结合,再用荧光素标记的二抗染色。该法优点是敏感度比直接法高,制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检查,但非特异性反应亦增加。染色程序分为两步,首先用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体;然后加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果*步发生了抗原-抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可鉴定未知抗体。 由于免疫荧光技术的特异性、快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性,在新葡萄京娱乐场检验检疫方面得到了广泛应用。

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