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新葡萄京娱乐场-新葡萄京娱乐场ELISA新葡萄京娱乐场的处理操作方法
发布时间:2021-10-21   点击次数:63次
  新葡萄京娱乐场-新葡萄京娱乐场C-反应蛋白ELISA新葡萄京娱乐场的处理操方法有哪些呢?今天大家来详细讲解一下!
 
  纯化的新葡萄京娱乐场-新葡萄京娱乐场C-反应蛋白(CRP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中加入C-反应蛋白(CRP),再与HRP标记的C-反应蛋白(CRP)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-反应蛋白(CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中新葡萄京娱乐场-新葡萄京娱乐场C-反应蛋白(CRP)的含量。
 
ELISA实验

       样本处理及要求:

  1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
 
  2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
 
  3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
 
  4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
 
  5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
 
  6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
 
  7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
 
  操作步骤:
 
  标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在*、第二孔中分别加标准品100μl,然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为1800μg/L,1200μg/L ,600μg/L,300μg/L,150 μg/L)。
 
  加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品zui终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
 
  温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
 
  保存条件及有效期:
 
  1.新葡萄京娱乐场保存:;2-8℃。
 
  2.有效期:6个月
 
  注意事项:
 
  ELISA新葡萄京娱乐场从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
 
  浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
 
  各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
 
  请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔*孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请zui后乘以总稀释倍数(×n×5)。
 
  封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
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